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PCR新手指南系列:PCR產(chǎn)物電泳條帶分析

更新時間:2016-03-16點(diǎn)擊次數(shù):2843

PCR擴(kuò)增后一般進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,電泳后一般有以下幾種條帶:
1、引物帶。引物濃度過高或是擴(kuò)增效率不是特別高時都會有,一般不呈現(xiàn)為細(xì)帶,為發(fā)散狀;如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶和引物帶都很亮,可以考慮適當(dāng)降低引物量。

2、引物二聚體帶。比引物跑得慢一點(diǎn),條帶清晰,但如果擴(kuò)增產(chǎn)物小于100bp時,產(chǎn)物與引物二聚體就不好分別了,建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳(不是蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺電泳);如果引物二聚體在優(yōu)化復(fù)性溫度后仍然嚴(yán)重影響目的產(chǎn)物的擴(kuò)增,優(yōu)先考慮更換引物設(shè)計(jì)(因?yàn)橐锖铣傻某杀颈确磸?fù)優(yōu)化條件的成本低)

3、目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計(jì)大小相同,條帶清晰。

4、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計(jì)大小不相同,條帶清晰。一般考慮通過提高復(fù)性溫度來減少或消除(也可用溫度梯度功能來尋找*的復(fù)性溫度,東勝龍811型PCR儀就有此功能)。如果其片段大小比目的片段大較多,可以通過減少延伸時間來減少或消除(即不給它足夠的延伸時間)。還有一種非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶是來自于逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)時的基因組DNA的污染,如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物中有內(nèi)含子,擴(kuò)增產(chǎn)物很可能大于目的基因。這種條帶通過優(yōu)化復(fù)性溫度是不能消除的,可以在逆轉(zhuǎn)錄前用無RNA酶的DNA酶進(jìn)行樣本處理。

5、模板DNA帶。模板濃度過高時可能出現(xiàn)。如果是基因組DNA為模板,條帶可能會很亂且較大。一般進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,模板濃度都不要太大,否則會產(chǎn)生一些比目的基因長一點(diǎn)的雜質(zhì)DNA(可能不成條帶,也看不到),這是由PCR擴(kuò)增原理造成的。

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