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上海嘉鵬對PCR引物設計原則的簡介

更新時間:2016-03-18點擊次數:3081


首先引物與模板的序列要緊密互補,其次引物不能在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配) ,再次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構。引物設計應注意如下要點:
1.引物的長度一般為15-30 bp,常用的是18-27 bp。
2.引物序列在模板內應當沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導致錯配。引物3’端出現3 個以上的連續堿基,如GGG 或CCC,也會使錯誤引發機率增加。
3.引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率,末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3個堿基,因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。
4.引物序列的GC 含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.引物的另一個重要參數是熔解溫度(Tm)。這是當50%的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。合理的退火溫度從55℃到70℃。為獲得*結果,兩個引物應具有近似的Tm值。
6.引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR 反應失敗。應該盡量避免。

 

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